Ratchanok Sirikharin1,2,3，Suparat Taengchaiyaphum1，Kallaya Sritunyalucksana1,2，Siripong Thitamadee1,3，唐伟章弗莱格尔1,5，Rapeepat Mavichak6和Porranee Proespraiwong6
1. Centex公司虾，玛希隆大学理学院，RamaVI路，曼谷，泰国
2.虾病毒的相互作用实验室（ASVI），国家中心的遗传工程和生物技术（BIOTEC），国家科技发展局（NSTDA），拉玛六世路，曼谷，泰国
3.生物技术科学学院，玛希隆大学，RamaVI路系，泰国曼谷
5.国家中心的遗传工程和生物技术（BIOTEC），国家科技发展局（NSTDA），巴吞他尼，12120，泰国
6.水生动物健康研究中心，正大有限公司，二分之八十二M. 4，拉玛2路，41.5公里，T. Bangtorat，A.孟Samutsakorn，Samutsakorn 74000，泰国
背景
在这里，我们描述了一种新方法，用于检测分离副溶血性弧菌这引起急性肝胰腺坏死病（AHPND）。该方法是基于蛋白质的基因序列中的无细胞培养液的亚级分发现从分离株五parhaemolyticus这项事业AHPND，但不能从副溶血性弧菌或其他细菌不会引起AHPND。当通过管饲法反向给予虾此无细胞制备物引起的急性AHPND（肝胰腺小管上皮细胞的大量脱落）的典型体征。它包含了58和12 kDa的两个突出的蛋白电泳带。后的肽片段的质谱法从这些蛋白质和后后续分析单独导出通过MASCOT，据透露，他们不得不显著同源性对抗昆虫细菌毒素。设计引物以扩增用于从AHPND细菌这些蛋白质的完整基因序列。所产生的扩增子测序后，设计引物PCR法检测这些蛋白质的基因，并与AHPND和非AHPND细菌分离的许多分离的初步试验显示，这两种方法给所有AHPND分离而是积极成果58 kDa蛋白单独也给了一些非AHPND株阳性结果。因此，进一步的测试均使用仅用于12 kDa蛋白的PCR方法。98个细菌分离物测试由非AHPND（35）和AHPND的（49）副溶血弧菌菌株（总84）证实了生物测定和细菌的14个其它分离株通常虾池发现包括其它物种弧菌和发光菌的。结果所有49个AHPND菌株为阳性与测试而对于所有其余分离株结果均为阴性。 This gave 100% sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value for the new method when compared to 100% sensitivity, 97.7% specificity, 97.4% positive predictive value and 100% negative predictive value for the previously recommended AP2 PCR method that was evaluated using a similar set of 80 bacterial isolates. The isolate that gave a false positive test result in the test with the AP2 method was included in the test of the new method and it gave a correct, negative test result.
从这些结果，我们建议我们先前宣布的AP1和AP2引方法与此，为了方便，我们想调用AP3引物法新方法所取代。我们也想建议谨慎调用12 kDa蛋白毒素，因为它的异源表达形式的毒性试验尚未完成。也没有被与58 kDa蛋白来完成。尽管这两种蛋白给从AHPND细菌生物活性培养液中部分优势带，即使他们有相似先前报道的昆虫毒素，他们可能会或可能不会是负责大量的细胞脱落AHPND的特征。尽管不确定性，AP3方法的效用已被证明优于该AP2和以前一样，我们希望可以自由地分散检测AHPND细菌的工具，并在努力控制蔓延尽快应用这种新的疾病。
的AP3引物靶加引物和PCR协议的序列中给出自由下列应用在检测AHPND细菌。对于那些谁先前已经确定副溶血性弧菌分离，让与AP2方法阳性PCR检测结果，但尚未进行虾的生物测定，我们推荐AP3方法中的额外的测试才这样做的。正如前面推荐的方法AP2，我们不建议使用这种方法来巢式PCR的适应。1步PCR法是足够灵敏以从细菌分离株的DNA提取物。然而，从虾组织，如HP和胃，从亲鱼或幼虾的粪便，从整个后期幼体和其他可疑的运营商，并从环境来源如池塘底质样品，我们建议在TSB含1.5％NaCl的初步富集步骤补充温育4小时，在约30℃下振荡。在此之后，让任何碎屑沉降，然后除去上清液混浊，离心以沉淀细菌，弃去上清液溶液。从细菌沉淀和使用约100ng模板用于每个PCR测试的提取物的DNA。
该PCR方法的详细信息
PCR引物
AP3 |
5'-3’ |
长度 |
％GC |
Tm值 |
钽 |
预计扩增子 |
F |
ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC |
26 |
23.08 |
57.63 |
53 |
336基点 |
[R |
GTGGTAATAGATTGTACAGAA |
21 |
33.33 |
55.46 |
PCR反应条件
组件 |
微升 |
协议 |
|||
10X PCR混合物 |
2.5 |
变性 |
94℃，5分钟 |
||
50毫摩尔MgCl2 |
0.7 |
30个循环 |
|||
变性 |
94℃，30秒 |
||||
10毫摩尔dNTP |
0.4 |
退火 |
53℃，30秒 |
||
10μMCN2-F1 |
0.5 |
延期 |
72℃，40秒 |
||
10μMCN2-R1 |
0.5 |
最后 |
72℃，5分钟 |
||
的Taq DNA聚合酶 |
0.2 |
||||
总 |
25.0 |
||||
> AP3靶序列336个碱基
ATGAGTAACAATATAAAACATGAAACTGACTATTCTCACGATTGGACTGTCGAACCAAACGGAG
GCGTCACAGAAGTAGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACAT
TGAGAATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCCATTTATGGCTGGC
GGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACAACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGCCCTG
ATAATGCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGTTTCTGTAC
AATCTATTACCAC
致谢
这种PCR法和底层蛋白质组学工作是由泰国的科学家合作，在泰国虾Centex公司和水生动物健康研究中心开发研制。它也完全由来自泰国的科研经费支持。在2013年初然而，它也使用的信息和材料之前获得长：工作发生陈德良，努南，雷德曼，Mohney，潘托哈，菲茨西蒙斯和莱特纳（45-55派息Aquat组织105）的开创性公布之后。因此，我们要感谢我们的AHPND研究从农业研究和发展机构的支持和鼓励，泰国国家研究理事会，泰国委员会高等教育，玛希隆大学，国家科技发展局，北大年虾农俱乐部，Surathani虾农俱乐部，泰国冷冻食品协会，正大公司，SyAqua有限公司和泰盟有限公司